血小板功能检测方法学进展

2019-10-29 16:01 来源:丁香园 作者:
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众所周知,根据最新的细胞学凝血机制理论,血小板在止凝血过程中的作用进一步被加强,被认为是中心的关键的一环,血小板活化过程中的膜表面、释放的颗粒物等均对凝血过程有贡献(图 1 和图 2)。事实上,除了止血功能外,血小板的其他新功能不断被发现:参与炎症的调节、机体的免疫防御、伤口愈合、肿瘤生长和转移等。因此在临床活动中,对血小板功能性监测越来越重视。


图 1. A Cell-based model of hemostasis


图 2. 血小板参与凝血的机制

▊ 血小板功能检测

近年来,血小板功能的评估在各种临床环境中变得越来越必要:1)识别出血性疾病患者;2)监测抗血小板治疗的反应;3)评估围手术期止血;以及 4)在输血医学中指导成分输血。事实上,血小板功能检测需要基于不同的检测原理以反应血小板不同的问题,很少有实验能够「一体化」反应血小板活化途径。

目前市场上有几种主流的血小板功能检测系统,根据检测原理可分为四大类:1)基于血小板粘附和聚集的评估;2)基于剪切力作用;3)基于血凝块粘弹性物理性质的分析;4)基于血小板表面标志物的测量。表 1 中汇总了不同方法的具有代表性检测系统,我们对其中几个重点方法作阐述。

表 1. 不同原理的血小板功能检测系统
方法标本类型基本原理
1. 基于血小板聚集
透光率比浊法(LTA)枸橼酸化富血小板血浆富血小板的血浆(PRP)是相对不透光的细胞混悬液,血小板聚集后透光率增加,通过测定 PRP 样本透光率的变化可以分析血小板的功能。
电阻抗法(代表:Multiplate™ analyzer,Plateletworks)枸橼酸化全血利用电阻抗原理通过连续计数,检测不同激活剂诱导下血小板聚集情况。
2. 基于剪切力
PFA-100/PFA-200枸橼酸化全血在高切变率条件下,利用不同激活剂激活血小板,检测血小板聚集情况。
3. 基于血液粘弹性物理性质的分析
血栓弹力图(血小板图)枸橼酸化全血,肝素化全血用物理学原理监测血凝块形成的全过程,有特定参数和试剂反应血小板功能和血小板对药物的反应性。
ROTEM枸橼酸化全血,肝素化全血
SONOCLOT枸橼酸化全血
4. 基于血小板表面标志物的测量
流式细胞学方法枸橼酸化全血,PRP利用抗原抗体原理,使用已经抗体检测血小板表面标志物,如膜表面标志物。
ELISA 方法PRP通常用于检测可溶性的血小板释放物,如 PF4,β-TG,可溶性 P-选择素,血栓烷 A2 及代谢物等。

01 透光率比浊法(LTA)

透光率比浊仪(LTA)曾一度被认为是血小板功能检测的金标准。其原理为:富血小板的血浆(PRP)是相对不透光的细胞混悬液,血小板聚集后透光率增加,通过测定 PRP 样本透光率的变化可以分析血小板的功能。富血小板血浆在各种诱聚剂作用下发生血小板聚集,PRP 的悬浊度下降,透光率增加【贫血小板血浆(PPP)样本的透光率设定为 100%】,因此 LTA 可实时测定血小板聚集的动态变化(以百分比表示)。

因为血小板可以被多种诱聚剂、在不同的浓度条件下激活,因此 LTA 检测的优点之一就是灵活性。血小板之间相互作用的动力学信息与血小板激活的不同阶段---从血小板形态变化到释放颗粒、从不稳定的聚集到牢固聚集--相对应,这些动态变化可由电子显微镜观察确认。因此 LTA 为详细研究血小板的活化途径提供了可能,在过去 50 年中成为大多数专业实验室研究血小板功能的优选方案。

但是从另一角度看,LTA 是一种相对非生理条件的试验:需从全血中分离血小板;低剪切力搅动;需加入诱聚剂才产生聚集。这些试验条件不能完整模拟血管壁损伤导致的血小板粘附、活化和聚集过程。传统的 LTA 试验要检测一整套血小板诱聚剂,需要大量的血样,操作人员必须具备深厚的专业操作训练和结果解读能力,容易受一些外在条件影响。由此促使人们试图开发出自动 LTA 分析仪或新的、更容易操作的血小板功能检测方法。其他检测方法因此应运而生。


图 3. LTA 原理示意图

02 电阻抗法

电阻抗法检测原理是血小板凝聚过程中血液样本的电阻抗会发生变化。检测时把正负两个电极浸入生理盐水稀释的全血样本中,用常规血小板诱聚剂启动血小板凝聚,同时记录血小板凝聚过程中血液样本电阻抗的变化。Multiplate 分析仪(罗氏诊断,瑞士巴塞尔)和 Plateletworks(海伦娜,美国)属于此类。基于电阻抗法检测原理的大部分设备均可根据不同的应用,预先设置相应的诱聚剂,用于出血疾病的诊断和监控抗血小板药物的疗效。

正如试验名称所示,本检测法使用全血样本,这是电阻抗法对抗 LTA 的主要优势。但是,有几项已知的因素大大影响电阻抗法的临床应用,包括血样的红细胞比容、血小板计数、使用的抗凝剂、从血样采集到检测的时间间隔等。此项试验需要的血样小,标本不需要离心处理,因此不会导致血小板活化或部分血小板亚群丢失,而且所需时间短,上述优势使其成为一项令人感兴趣的临床检查方法,尤其是用于监控抗血小板药物的疗效和围术期血小板功能检测。然而,由于缺乏此方法在分析血小板功能障碍方面的数据,限制了其在遗传性血小板疾病研究中的应用。

03 血栓弹力图

血栓弹力图检测方法的出现被认为是凝血功能检测史上的一次革命。血栓弹力图血液粘弹性检测的方法学(Viscoelastic coagulation assay, VCA),1948 年由德国学者 Hartert 首次提出,通过监测血凝块形成过程中的粘弹性变化从而评估从血栓形成到溶解的整体止血功能。

血栓弹力图检测有多种不同的试剂组合,可以单独使用,也可以联合使用,可以监测用 AA 或 ADP 途径抗血小板药物的疗效,因此此项检测可用于研究血小板功能和监控抗血小板药物。血栓弹力图系统中,检测血小板功能的主要指标是血小板聚集抑制率,定义为 [(MAADP  或 AA-MA 纤维蛋白)/(MA 凝血酶-MA 纤维蛋白)] ×100%; 其中 MAAA  是指花生四烯酸(arachidonic acid,AA)诱导的血凝块最大振幅,MAADP  是指二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)诱导的血凝块最大振幅,MA 纤维蛋白是指纤维蛋白的血凝块最大振幅,MA 凝血酶是指凝血酶诱导的血凝块最大振幅,结果解读见(表 2)。

血栓弹力图的主要优点是直接以全血为标本,能提供一个直观的完整的血液凝集发生、发展和变化的过程,包括凝块形成的动态变化、凝块强度和纤维蛋白溶解,缺点是对中度以下的血小板功能变化不敏感。目前临床上主要使用血栓弹力图方法用于:
1)监测整体的凝血功能;
2)指导个性化输血策略,尤其是大出血时的输血管理;
3)监测肝素和抗血小板药物疗效。


图 4. 血栓弹力图结果示意图

表 2. 血小板图检测结果解读
结果解读AA 途径:阿司匹林等ADP 途径:氯吡格雷、普拉格雷等
AA 抑制率 %ADP 抑制率 %
药物高反应性(出血风险)>90%>90%
药效较好50% - 90%30% - 90%
药物低反应性(血栓风险)<50%<30%

不可否认,血栓弹力图在临床的实际应用当中,仍存在一定的局限性,例如无法检测由血小板与血管内皮相互作用异常导致的血小板功能障碍 (如尿毒症患者);常规血栓弹力图采用凝血酶作为血小板激动剂,若患者已接受抗血小板治疗,则常规血栓弹力图就无法反映患者的凝血功能;目前尚缺乏统一的参考标准,现行的正常值范围较大,给临床解读血栓弹力图结果带来了一定的困扰等问题,但这些缺陷并不妨碍它成为目前世界上最先进的凝血检测手段之一。

▊ 总结

过去 50 年真正是血小板功能检测的黄金时代,LTA 和流式细胞术的使用促进了我们对血小板生物学、生理学和病理学的理解。与此同时,通过对能有效抑制血栓形成的血小板靶点的了解,使科研人员开发出了各种抗血小板药物。简便易用的床旁检测方法使得血小板功能检查更靠近患者,而不必在专业的血液学实验室中进行。目前血小板功能检测所面临的挑战包括:1)确定这些检测方法对于预测血栓形成和出血是否具有真正的临床指导意义;2)针对每一个患者开发出个体化的解决方案,减轻患者的临床风险。

血小板功能检测正处于精准医学和深度表型分析等新时代的前沿,全面细致的血小板功能分析越来越多地用于多种研究领域,其中血小板生物学和生理学的研究推动了对炎症、免疫和癌症等复杂生物系统的理解。

未来的血小板功能检测将从高通量深度表型分析等技术收集丰富的数据,并将这些成果转化为切实可行的疾病诊断依据和理想的药物治疗靶点,从而改进病人的预后。总之,血小板功能的检测正处于特别有趣的时期,新开发的诊断技术和仪器将可能应用于各种不同的临床部门和实验室。

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